雜草會嚴重威脅作物產(chǎn)量，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失。與人工除草相比，除草劑具有經(jīng)濟、快速、高效等優(yōu)點，為農(nóng)業(yè)的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)提供了重要保障。然而，近年來，長期、單一、廣泛使用除草劑，導(dǎo)致了抗性雜草個體和種群逐年增加，降低了除草劑的防治效果，增加了雜草防治成本；同時，除草劑使用劑量增加也易造成農(nóng)作物藥害風(fēng)險和環(huán)境污染。目前，雜草抗性問題已經(jīng)是威脅糧食作物生產(chǎn)的重要問題之一。因此，開發(fā)安全性高、效率高的新型除草劑具有重要意義。
天然產(chǎn)物小分子與生物在自然界中共同進化，其生物學(xué)活性能夠干預(yù)特定細胞的代謝途徑，因而在醫(yī)藥健康及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著非常重要的作用，如抗菌藥物青霉素、抗瘧疾藥物青蒿素以及降脂藥物洛伐他汀等。因此，開發(fā)和應(yīng)用具有新型生物學(xué)活性的天然產(chǎn)物對生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)科學(xué)等廣大領(lǐng)域具有重要意義。到目前為止，要發(fā)掘具有優(yōu)異活性的天然產(chǎn)物，靠的主要是以生物學(xué)活性為導(dǎo)向的高通量篩選。然而，隨著后基因組時代的到來，如何綜合利用生物信息學(xué)以及合成生物學(xué)等方法，從大量的基因組序列信息來發(fā)現(xiàn)具有新型生物學(xué)活性的天然產(chǎn)物成為亟待解決的難題。
2018年7月11日，美國加州大學(xué)洛杉磯分校唐奕教授課題組、Steven Jacobsen教授課題組和上海有機化學(xué)研究所周佳海研究員課題組聯(lián)合瑞士的袁曙光博士在Nature雜志在線發(fā)表了題為Resistance gene-directed discovery of a natural-product herbicide with a new mode of action的研究論文。該研究運用以抗性基因為導(dǎo)向的基因組挖掘技術(shù)成功發(fā)現(xiàn)了一種新型天然產(chǎn)物除草劑aspterric acid (AA)，通過靶向植物支鏈氨基酸合成途徑(BCAA)中的二羥酸脫水酶（DHAD)而抑制植物的生長。該研究首次解析了DHAD全酶的結(jié)構(gòu)，并利用計算化學(xué)闡明了AA與酶活性中心的結(jié)合機制，揭示了新型除草劑產(chǎn)生效能的分子機制。同時，利用產(chǎn)生菌自身的抗性基因，成功構(gòu)建了具有AA耐受性的轉(zhuǎn)基因作物。該工作不僅為挖掘基因組尋找天然產(chǎn)物提供了新的方法和啟示，同時也為探索農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中開發(fā)新型除草劑提供了范例。
支鏈氨基酸（ branched chain amino acid,（BCAA），包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）是植物生長必需的營養(yǎng)成分，其生物合成途徑由三個酶組成：乙酰乳酸合酶（ALS）、乙酰羥酸異構(gòu)還原酶（KARI）和二羥酸脫水酶 (DHAD)。DHAD在BCAA途徑中催化α,β-二羥酸脫水反應(yīng)生成亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸的前體α-酮酸。這個參與植物必須氨基酸合成的酶DHAD在不同的植物物種中高度保守，即使在進化遠端的植物中依然有80%的同源性。哺乳動物體內(nèi)不存在BCAA生物合成途徑，它們依靠食物攝取這些三種必須氨基酸，因此DHAD被認為是理想廣譜除草劑的靶點。早在20年前，杜邦公司的科學(xué)家們就曾成功地設(shè)計出了針對DHAD的小分子抑制劑，然而當(dāng)將其施用在植物體時，這些化合物分子卻無法抑制植物的生長。
天然產(chǎn)物與生物體在自然界中共同進化，產(chǎn)生具有能夠干預(yù)特定細胞代謝途徑的生物學(xué)活性，因此，在自然界中可能存在抑制必需氨基酸合成途徑上DHAD的天然抑制劑?；谶@一假設(shè)，唐奕課題組推測這樣的天然抑制劑生物合成基因簇必然包含一個編碼DHAD同源蛋白的基因。這個DHAD同源蛋白對于抑制劑不敏感，可以提供給生產(chǎn)者耐受這種抑制劑的能力，使生產(chǎn)者在合成這種抑制劑的同時，自身可以生存下來。通過篩查已公開的所有真菌基因組，研究人員找到了一個與DHAD同源基因和天然產(chǎn)物合成基因連鎖的保守基因簇。這個保守基因簇由四個基因構(gòu)成，這四個基因分別編碼倍半萜環(huán)化酶同源蛋白AstA，兩個細胞色素P450氧化酶(AstB和AstC)，以及一個DHAD的同源蛋白(AstD)。通過在酵母中異源表達astA, astB, astC基因，他們發(fā)現(xiàn)這個簇的最終產(chǎn)物為aspterric acid (AA)。
Genome mining of a DHAD inhibitor and biosynthesis of aspterric acid.
AA雖然是一個已知化合物，但由于人們對其生物學(xué)活性產(chǎn)生的機制不了解，這個天然產(chǎn)物自首次被分離40多年以來一直為人們所忽視。唐奕課題組通過抗性基因為導(dǎo)向的基因組挖掘策略發(fā)現(xiàn)了這個被人們忽視的小分子，并利用生物化學(xué)手段證明了AA的生物學(xué)活性。同時，研究人員也證明了AstD具有DHAD的功能，卻對AA具有極高的耐受性。盡管AA可以很好的抑制DHAD的活性，但是否能夠很好的抑制植物生長是開發(fā)新型除草劑的關(guān)鍵。通過對模式植物擬南芥、單子葉植物玉米和雙子葉植物番茄的抑制實驗，唐奕課題組和Steven Jacobsen課題組進一步證實了AA對于植物生長具有廣譜的抑制性。
Aspterric acid is a plant growth inhibitor.
周佳海課題組對DHAD全酶結(jié)構(gòu)進行了首次解析，結(jié)合計算化學(xué)手段，AA與酶活性中心的結(jié)合機制，以及AstD具有AA耐受性的分子機制也被闡明。研究發(fā)現(xiàn)，具有特殊三環(huán)結(jié)構(gòu)的AA可以模擬天然底物α,β-二羥酸與活性中心二鐵二硫簇和鎂離子的結(jié)合模式，并且能夠通過具有較大位阻的三環(huán)結(jié)構(gòu)及側(cè)鏈，與活性中心入口處疏水氨基酸殘基發(fā)生疏水作用，以更高的結(jié)合能與DHAD的活性中心結(jié)合。
X-ray Structure of holo-AthDHAD and homology model of AstD.
為進一步使AA在除草的同時不影響作物的生長，研究人員將抗性基因AstD在擬南芥中表達，并成功獲得可以耐受高濃度AA的轉(zhuǎn)基因植株。這一結(jié)果表明，可以利用AstD抗性基因開發(fā)具有AA耐受性作物，從而實現(xiàn)利用AA進行專一性除草，而不影響作物的目的。這一工作不僅為挖掘基因組尋找天然產(chǎn)物提供了新的方法和啟示，同時也為探索農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中開發(fā)新型除草劑提供了范例。
Aspterric acid-resistance of Arabidopsis plants expressing astD transgenes.
